Джон Гамбург родился 26 мая 1970 года в городе Манхэттен, Нью-Йорк, США. Появился на свет в еврейской семье. Его родители Джоан Гамбург и Мортон И. Гамбург работали на Нью-Йоркском радио. В 1992 году окончил Университет Брауна, со степенью в области истории. Затем он учился в школе искусств «Tisch» в Нью-Йоркском университете.

    После показа его короткометражки «Tick» на кинофестивале «Сандэнс» - «Sundance», Гамбург написал сценарий и снял фильм «Медвежатники» - «Safe Men». Так же написал сценарии для телесиреалов, такие как: «Добро пожаловать в Капитана» - «Welcome to the Captain» 2008 года, короткометражка «Монстр» - «The Monster».

    Гамбург написал сценарий для сиквела фильма «Знакомство с родителями», более известно как под названием «Знакомство с Факерами». Так же был исполнительным продюсером этого фильма.

    Позднее, он получил успех как автор сценария для фильмов «Знакомство с родителями» - «Meet the Parents» и «Образцовый самец» - «Zoolander», и вернулся в режиссерское кресло с фильмом «А вот и Полли» - «Along Came Polly», для которого он также написал сценарий. Является режиссером таких сериалов - «Новенькая» - «New Girl» 2011 года, «Стелла» 2005 года.

    В 2009 году Гамбург написал снял популярную комедию «Люблю тебя, чувак» - «I Love You, Man», которая заработала в прокате почти 100 миллионов долларов - отменный результат для романтической истории с рейтингом R. Впрочем, сами создатели определяют жанр фильма несколько иначе. За основу сценария, была взята идея рукописи Ларри Левина.

    Джон Гамбург женат на актрисе Кристине Кирка.