Стефан Махрищицкий родился и воспитался в городе Киев. Молодой человек постригся в Печерской обители и провел там несколько лет в послушании и молитве. Сте­фан являлся современником и бли­жай­шим со­бе­сед­ни­ком пре­по­доб­но­го Сер­гия Ра­до­неж­ско­го. Согласно житию, притеснения папистов заставили его вместе с другими печерскими иноками искать убежища в Москве, где его благосклонно принял великий князь Иван II. Оставшись верным законному киевскому митрополиту в Москве Стефан поставил себе келью в уделе московского князя в уединенном месте на берегу реки Махрищи, в 35 верстах от обители Сергиевой.

Желая сохранить безмолвие, Стефан сначала не хотел принимать приходивших к нему, но потом уступил их просьбам и в 1358 году основал обитель. Живший близ Махры благочестивый человек отдал обители Махрищской свою усадьбу с засеянными полями, сам принял иночество с именем Григория и являлся любимым учеником Стефана.

Это было не по сердцу соседним владельцам: они знали уважение великого князя Дмитрия к Стефану и опасались, чтобы земли, которыми владели, не перешли во владение монастыря. Четверо из них, братья Юрцовские, подняли гонение на игумена и грозили убить его, если не уйдет из Махры. Стефан удалился вместе с Григорием на север и в 60 верстах от Вологды, на реке Авнеге, основал в 1370 году пустынную обитель с храмом святой Троицы. Великий князь Дмитрий Иванович прислал пожертвования, а Стефана вызвал обратно в Махрищскую.

Достигнув глубокой старости, преподобный Стефан передал игуменство старцу Илии и принял великую схиму. В скором времени, чувствуя приближение своей кончины, созвал и в последний раз поучил братию подвигам духовным, страху Божию и непрестанной памяти смертной, любви нелицемерной, воздержанию и конечному отречению от мира. И причастившись Святых Христовых Таин, предал преподобный Стефан чистую свою душу Богу 14 июля 1406 года. Благоухание святой его жизни повеяло от святых его мощей, свидетельствуя о благоприятном предстательстве его пред лицем Божиим. Со слезами братия погребли его в созданной им обители Живоначальной Троицы.

Мощи Стефана обретены 27 июля 1550 года нетленными при построении каменного храма святой Троицы, но оставлены в новом храме под спудом.

Житие святого написано игуменом, а впоследствии епископом Вологодским Иоасафом по воле митрополита Макария при пособии кратких записок, составленных столетним монахом Серапионом. Иоасафом же составлены описание чудес Стефана и служба ему. В начале XVII века Махрищская обитель, разоренная поляками, приписана к Сергиевой лавре.