Уиллем Дефо родился 22 июля 1955 года в городе Эпплтон, штат Висконсин, США. Он с детства увлекался театром и искусством. Повзрослев, Уильям принимает решение изучать драматическое искусство. Он поступил в университете Милуоки, который так и не сумел закончить: начинающий актёр отправился на гастроли с авангардным театром «Theatre X». Уиллему, впрочем, не пришлось сожалеть о неоконченной учёбе в университете. Вместе с театром он очень успешно гастролировал по США и Европе в течении 4-х лет. Впоследствии Дефо поселился в Нью-Йорке, где начал работать в театральной труппе «The Performance Group».
В 1980 году молодой актёр снялся в фильме Майкла Чимино «Врата рая», однако кадры с его участием не вошли в конечную версию картины. В последующие годы Дефо снялся в фильмах «Нелюбимый» Кэтрин Бигелоу и «Жить и умереть в Лос-Анжелесе» Уильяма Фридкина, которые принесли ему известность. Критики позитивно оценили игру актёра.
В 1986 году за роль в фильме Оливера Стоуна «Взвод» Уиллем Дефо был номинирован на «Оскар» как «Лучший актёр второго плана». Эта роль является одной из самых удачных работ Дефо в кино. Не менее яркими были его роли в фильмах «Последнее искушение Христа», «Миссисипи в огне», «Рождённый четвёртого июля», «Дикие сердцем», «Английский пациент», «Прямая и явная угроза», «Тень вампира», «Авиатор», «Человек-паук», «Светлячки в саду», «Антихрист», «Воины света», «Прощальное дело», «Охотник», «Джон Картер», «Перекрестный огонь» и других.
Помимо активных съемок в кино, Уиллем Дефо также принимает участие в озвучивании мультфильмов.