Официальной датой основания донского казачества считается 3 января 1570 года. Поводом для образования Донских Казачьих Станиц-Застав стало признание их военных заслуг, нужда в их службе Русскому государству, и наделения Казачества грамотой Ивана Грозного. С 1570 года началось активное формирование Казачьего войска и обустройство Станиц-Застав.

Донское казачество значительно древнее этой даты. Еще в 1502 году московский князь Иван III знал о своеобразной моде рязанцев «пойти самодурью на Дон в молодечество». В 1552 году зафиксирован первый военный поход донских казаков на Волгу к стенам Казани под началом атамана Сусара Федорова. Спустя 4 года донские казаки Ляпуна Филимонова совместно с московскими ратями принимали участие в ликвидации Астраханского ханства.

Крах татарских государств на востоке создает условия для казацкой экспансии. В 1557 году атаман Андрей Шадра с тремя сотнями донцов положил начало Терскому казачеству.

До конца XVI века Донское казачье войско было абсолютно независимым. В 1584 году Донское войско давало присягу верности царю Федору Иоанновичу. В 1612-1615 годах войско переходило из ведения Разряда в Посольский приказ и присягало на верность Михаилу Федоровичу Романову. В результате, сношения Русского царства с донскими казаками, вплоть до начала XVIII века, шло через «посольский приказ», то есть, фактически, через «министерство иностранных дел».

Известно, что в ходе Великой Отечественной войны казаки сражались как на стороне Красной Армии, так и в вооруженных силах вермахта. В годы Советской власти казачество находилось в упадке. В 1980-е годы началось возрождение казачества. Учредительный Большой Круг Союза казаков, на котором участвовало 263 делегата, собрался в Москве 28 июня 1990 года. Атаманом союза казаков России был избран потомок донских казаков Александр Мартынов. 17 ноября того же года в Ростове-на-Дону открылся Съезд казаков Дона.

Столицей донского казачества закреплен Новочеркасск. В казачьей среде стали популярны идеи превращения Дона в особый автономный регион России на базе Ростовской области, к которой должны быть присоединены части Волгоградской области России, а также Донецкая и Луганская области Украины. Высказывалась мысль о признании донских казаков в качестве отдельного народа.

Донские казаки приняли участие в Приднестровском конфликте, защищая права русскоязычного населения республики. Президент Приднестровской Молдавской республики Игорь Смирнов приехал в Новочеркасск 12 июня 1994 года. Он вручил отличившимся казакам Дона награды: медали «Защитнику Приднестровья» и «За оборону Приднестровья».

В 1994 году в среде руководства донских казаков наметился раскол, усилившийся от неоднозначного отношения к Чеченской республике Ичкерия. В 1996 году в обход действующего атамана Козицина атаманом донского войска становится Вячеслав Хижняков, поддержку которому оказывают официальные власти на самом высоком федеральном уровне.

Раскол казачества проявился и в отношении к войне в Югославии. В 2005 году казаки Ростовской области были вовлечены в межэтнический конфликт с представителями чеченской диаспоры. В 2014 году казаки приняли участие в войне в Новороссии.