Сергей Скрипаль родился 23 июня 1951 года в городе Киев, Украина. В 1972 году окончил военно-инженерное училище в городе Калининград, по специальности сапер-десантник. После училища поступил в Военно-инженерную академию имени В.В. Куйбышева. Затем, из Воздушно-десантных войск перевелся в Главное управление Генерального штаба России, ГРУ.
В 1999 году Скрипаль ушел в отставку в звании полковника Вооруженных сил Российской Федерации. До 2001 года работал в управлении делами Министерства иностранных дел России, затем в Министерстве территориальных образований Московской области. Преподавал в Военно-дипломатической академии.
Параллельно Сергей Викторович занимался предпринимательской деятельностью. В начале 2000-х годов выступил совладельцем компании «Юниэкспл», занимавшейся разминированием местности, проводившей специальные взрывные работы и утилизирующей устаревшие боеприпасы и боевую технику. Компанию закрыли в августе 2016 года.
Федеральная служба безопасности России 15 декабря 2004 года арестовала его по обвинению в сотрудничестве с разведкой Великобритании. В ходе расследования уголовного дела, возбужденного по статье 275 уголовного кодекса РФ, выяснилось, что его завербовала «Секретная разведывательная служба МИД Великобритании, МИ-6, в 1995 году во время прохождения военной службы в Главном разведывательном управлении Вооруженных Сил РФ во время командировки в Испанию, где Скрипаль работал военным атташе посольства России.
После возвращения из Испании полковник руководил управлением кадров ГРУ и в силу этого обстоятельства хорошо знал личности российских военных разведчиков, работавших под прикрытием в разных странах. Скрипаль передавал британцам секретные сведения о российских военных объектах: о военном космодроме Плесецк в Архангельской области, в общей сложности около 20 тысяч совершенно секретных документов.
В ходе следствия Сергей Викторович признал себя виновным. Дал подробные показания о своей деятельности, что было учтено судом в качестве смягчающего обстоятельства при назначении наказания. В 2006 году, 9 августа, Московский окружной военный суд вынес обвинительный приговор, Скрипаля лишили всех званий и осудили на 13 лет лишения свободы в колонии строгого режима. Гражданства России Скрипаль лишен не был.
Президент России подписал указ о помиловании четырех граждан России, в том числе и Скрипаля, удовлетворив их прошения о помиловании, 9 июля 2010 года. Помилование произведено в рамках операции по обмену четырех граждан РФ, осужденных за шпионаж в пользу США и Великобритании и отбывающих наказание в России, на десятерых агентов российских спецслужб, граждан России, задержанных в США в июне 2010 года. Великобритания предоставила Скрипалю пенсию и гарантии поддержки в случае возникновения жизненных проблем.
Скрипаль после освобождения обосновался вместе с женой, сыном и дочерью на юго-западе Великобритании, в городе Солсбери, где также проживал завербовавший его ветеран британской разведки Миллер. Читал лекции о российской военной разведке в МИ-6 курсантам военных академий, а также давал консультации по военно-разведывательным вопросам. В обучающих целях рассказал иностранным спецслужбам о методах оперативной работы российских разведчиков, способах их проникновения в западные страны, применяемых ими технологиях вербовки, а также о том, как эффективно противодействовать российской разведке.
В 2018 году, 4 марта Сергея Викторовича и его дочь Юлию, приехавшая из города Москва навестить отца, нашли без сознания возле торгового центра в городе Солсбери без видимых телесных повреждений. Их экстренно госпитализировали в больницу города в состоянии тяжелого отравления редким нервно-паралитическим веществом. Оба оказались в реанимации в состоянии комы. В результате инцидента пострадал 21 человек, в том числе госпитализирован первым прибывший на место события полицейский Ник Бейли.