Сергей Пускепалис родился 15 апреля 1966 года в городе Курск. Мальчик вырос в семье геолога, поэтому долгое время жил на Чукотке в городе Билибино. После школы уехал в Саратов, где поступил в театральное училище на курс Юрия Киселева. Окончив училище ушел по призыву в вооруженные силы. Отслужив на флоте, в 1988 году вернулся в звании старшины первой статьи и устроился в Театр юного зрителя Саратова, которым руководил тот же Юрий Киселев.
Через десять лет Пускепалис стал уже заслуженным артистом. Самые известные постановки с его участием: «Эти свободные бабочки» и «Женитьба Белугина», где исполнил главные роли. Сергей всегда мечтал о поступлении в Российский Институт Театрального Искусства и поступил в конце 1990-х годов, попав на курс Петра Фоменко. На каникулах студент вместе с самарскими актерами принимал участие в постановке разных пьес. Среди участников этих проектов являлся сценарист и драматург Алексей Слаповский.
Так, появился необычный молодой самарский коллектив «Понедельник», который выступал на разных сценах. Режиссером выступал Пускепалис. Свой дипломный спектакль «Двадцать семь», выпускник театрального вуза так же поставил по пьесе Алексея Слаповского. Оказавшись очень удачным, постановку представили на фестивале «Балтийский дом».
Сергею удалось поработать под руководством Петра Фоменко, являлся ассистентом режиссера при постановке спектакля «Египетские ночи». В 2002 году Пускепалисом поставлен спектакль «Жизнь прекрасна». Зрителям представил свою работу на сцене Театра драмы и комедии Камчатки. На протяжении четырех лет, начиная с 2003 года, Сергей трудился в должности главного режиссера в Театре драмы города Магнитогорска.
За это время поставил ряд спектаклей: «Сирена и Виктория», «Володя», «Любовь к ближнему», «Исполнитель желаний», «Козий остров». С середины 2009 по февраль 2010 года Пускепалис в академическом театре драмы города Ярославля занимал должность главного режиссера. На его сцене являлся режиссером спектаклей «С любимыми не расставайтесь», «Три сестры».
Кино долгое время не было частью творческой жизни Сергея. Дебютировал в эпизоде кинокартины «Прогулка», которая снята Алексеем Учителем. Когда же его сын Глеб принимал участие в съемках фильма «Коктебель» у Алексея Попогребского, Сергей познакомился с этим режиссером. Вскоре Попогребский начал искать актеров на роли для своей очередной картины «Простые вещи», и предложил сняться в главной роли Пускепалису. Тот принял предложение и сыграл врача-анестезиолога Сергея Маслова.
В 2010 году Сергея пригласили на главную роль в картину с необычным названием «Как я провел этим летом». По сюжету два человека разных формаций и возрастов вынуждены рядом жить, здесь же затронута извечная проблема взаимоотношения отцов и детей. Сергей сыграл бывалого начальника полярной станции. Вторую главную роль сыграл Григорий Добрыгин. Его герой: практикант-стажер Павел. Съемки шли на настоящей полярной станции на севере Чукотки на протяжении трех летних месяцев. Именно это и позволило фильму быть очень близким к реальности. Погодные условия, не смотря на лето, оказались дичайшими. Фильм получился необычным, но зрители его приняли с восторгом. Отметил эту картину и Берлинский кинофестиваль, на котором исполнители главных ролей получили призы «Серебряный медведь».
В следующем, 2011 году году актер появился в фильмах: «Мой парень - ангел» и «Сибирь. Монамур». Через год снялся в кинолентах: «Метро», «Развод», «Жизнь и судьба». В 2013 году сыграл капитана государственной безопасности в телесериале «Крик совы» и «Черное море».
В августе 2014 года в рамках международного фестиваля «Край света» Сергей Пускепалис в качестве почетного гостя и члена жюри посетил Сахалин. Через год на кинофестивале «Золотой абрикос» в Ереване состоялась премьера фильма «Клинч», который Сергей снял в качестве кинорежиссера. Это экранизация пьесы Алексея Слаповского, которую Пускепалис ставил в Уфе.
Указом министра культуры России 4 декабря 2018 года Пускепалис назначен заместителем художественного руководителя МХАТ имени Горького по творческой работе.
Актер и режиссер Сергей Пускепалис, 16 августа 2019 года стал победителем конкурса концепций развития Театра имени Федора Волкова в Ярославле и назначен его художественным руководителем. В 2019 году стал членом совета по культуре Росгвардии.
Погиб 20 сентября 2022 года в автокатастрофе в Ярославской области, неподалеку от въезда в Ростов. Сергей Пускепалис перегонял купленный им микроавтобус для военных в Донбассе. Авария произошла в 11:14 на 202 км трассы М-8 в Ростовский районе, рядом с деревней Песочное. После столкновения с двумя многотонными фурами, автомобиль смяло и выкинуло с дороги. Микроавтобус «Форд-Транзит» по касательной столкнулся с грузовиком «Скания», который ехал по встречке. Из-за этого «Форд» выкинуло с полосы, и машина столкнулась с фурой «Даф». Сергей Пускепалис был на пассажирском сиденье. За рулем машины был водитель Волковского театра 57-летний Александр Синицын.
• 1999 — почётное звание «Заслуженный артист Российской Федерации» — «за заслуги в области искусства»
• 2015 - лауреат Премии ФСБ России
• 2019 - «За Заслуги» Министерство Обороны РФ
• 2007 — приз за лучшую мужскую роль на кинофестивале «Кинотавр» за роль в фильме «Простые вещи»
• 2007 — премия «Ника» в номинации «Открытие года» за роль в фильме «Простые вещи»
• 2007 — премия киноведов и кинокритиков «Белый слон» в номинации «Лучшая мужская роль» за роль в фильме «Простые вещи»
• 2007 — премия кинофестиваля «Меридианы Тихого» в номинации «Лучшая мужская роль» за роль в фильме «Простые вещи»
• 2007 — премия кинофестиваля в Карловых Варах в номинации «Лучшая мужская роль» за роль в фильме «Простые вещи»
• 2010 — «Серебряный медведь» за лучшую мужскую роль в фильме «Как я провёл этим летом» (вместе с Григорием Добрыгиным) на Берлинском кинофестивале
• 2013 — приз за лучшую мужскую роль XIX Российского кинофестиваля «Литература и кино» в Гатчине за роль в фильме «И не было лучше брата»
• 2014 — приз Ассоциации продюсеров кино и телевидения в номинации «Лучший актёр телевизионного фильма/сериала» (за роль Ивана Митина в сериале «Крик совы»)
• 2015 — приз за лучшую режиссёрскую работу («Клинч») на фестивале «Амурская осень» в Благовещенске
• 2016 — приз за лучший режиссерский дебют и приз прессы на кинофестивале «Виват кино России!» в Санкт-Петербурге (фильм «Клинч»)
• 2018 — премия «Золотой орёл» в номинации «Лучшая мужская роль на телевидении» за 2017 год за главную роль в телесериале «А у нас во дворе…».
Самарский театр «Понедельник»
• 2000 — «Уезжаю» А. Слаповского
• 2001 — «Козий остров» У. Бетти
• 2002 — «Тихий ангел» А. Слаповского.
Дипломные работы в РАТИ—ГИТИС
• 2001 — «Двадцать семь» А. Слаповского
• 2002 — «Прошлым летом в Чулимске» А. Вампилова
Саратовский театр юного зрителя имени Ю. П. Киселёва
• 1999 — «Рождество в доме Купьелло» Эдуардо де Филиппо
• 1999 — «Жизнь прекрасна» по рассказам А. П. Чехова
• 2000 — «Хунема». Сцены-этюды
• 2015 — «Приключения Солнышкина» пьеса А.Слаповского (по мотивам повести В. Коржикова)
Московский театр «Мастерская П. Н. Фоменко»
• 2001 — «Египетские ночи» по произведениям А.С. Пушкина и В.Я. Брюсова (ассистент П. Н. Фоменко)
Камчатский театр драмы и комедии (Петропавловск-Камчатский)
• 2002 — «Жизнь прекрасна» по рассказам и водевилям А.П. Чехова
Национальный молодёжный театр Республики Башкортостан имени Мустая Карима (Уфа)
• 2005 — «Клинч» А. Слаповского
Челябинский государственный академический театр драмы имени Наума Орлова
• 2004 — «ОБЭЖ» Б. Нушича
Омский государственный драматический «Пятый театр»
• 2007 — «От красной крысы до зелёной звезды» А. Слаповского
Магнитогорский драматический театр имени А. С. Пушкина
• 2003 — «Козий остров» У. Бетти (приз лучший спектакль Челябинской области)
• 2003 — «Такси. Скорость. Две жены…» Р. Куни
• 2004 — «Блин-2» А. Слаповского (приз за лучшую режиссуру – Тюмень «Золотой Конёк)
• 2006 — «Любовь к ближнему» Л. Андреева, Д. Буцатти
• 2006 — «Исполнитель желаний» А. Курейчика
• 2007 — «Сирена и Виктория» А. Галина
• 2007 — «Женитьба Фигаро» П.О. Бомарше
• 2007 — «Володя» А.П. Чехова
Московский театр-студия под руководством Олега Табакова
• 2007 — «Женитьба Белугина» А.Н. Островского, Н.Я. Соловьёва
• 2019 — «Русская война Пекторалиса» по повести Н.С. Лескова «Железная Воля»
Российский государственный академический театр драмы им. Фёдора Волкова (Ярославль)
• 2009 — «С любимыми не расставайтесь» А. Володина
• 2010 — «Три сестры» А.П. Чехова
• 2010 — «Бедный миллионер» А. Слаповского
• 2020 — «...Забыть Герострата!» Г. Горина
• 2021 — «Предстоящее событие» И. Глинкова
• 2022 — «Весы» Е. Гришковца
Московский драматический театр «Современник»
• 2009 — «Бог резни» Я. Резы
МХТ им. А.П. Чехова
• 2011 — «Дом» Е. Гришковца
• 2012 — «Прошлым летом в Чулимске» А. Вампилова
МХАТ им. М. Горького
• 2019 — «Последний срок» В. Распутина
2003 - Прогулка - участник аварии
2006 - Простые вещи - Сергей Маслов, врач-анестезиолог в питерской больнице
2009 - Скоро весна - Павел Николаевич
2010 - Аптекарь - Михаил Никифорович Стрельцов, аптекарь
2010 - Как я провел этим летом - Сергей Витальевич Гулыбин, начальник
2010 - Попытка Веры - Сергей Николаев
2010 - Грозное время - Андрей Курбский
2011 - Сибирь. Монамур - Владислав Николаевич, подполковник
2011 - Мой парень - ангел - Сан Саныч, вулканолог, отец Александры
2011 - Защита свидетелей - Андрей Иванович Мешечко, майор, заместитель начальника
2011 - И не было лучше брата - Джалил
2012 - Жизнь и судьба - Иван Иванович Греков, капитан-артиллерист
2012 - Некуда спешить (новелла «Конец дежурства») - инспектор
2012 - Развод - Михаил, полковник РОВД
2012 - Написано Сергеем Довлатовым - озвучивание, текст от первого лица
2013 - Метро - Андрей Гарин, врач-хирург районной больницы
2013 - Крик совы - Иван Александрович Митин, капитан госбезопасности
2013 - Люби меня / Sev beni - Александр
2013 - Восьмерка - командир ОМОНа
2013 - Новая жизнь - Игорь Валерьевич
2014 - Черное море / Black Sea (Великобритания) - Зайцев
2014 - Крестный - Илья Борисович Алехин, врач, акушер-гинеколог
2014 - 9 дней и одно утро - Иван Вениаминович, мэр города
2015 - А у нас во дворе… - Владимир Сергеевич Каленый, отставной полицейский
2015 - Битва за Севастополь - командир
2016 - Ледокол - Валентин Григорьевич Севченко, новый капитан ледокола «Михаил Громов»
2016 - София - Казимир IV, великий князь литовский
2017 - Доктор Анна - Андрей Александрович Добровольский, генерал
2017 - Карп отмороженный - Сергей Анисимов, патологоанатом
2017 - Большие деньги (Фальшивомонетчики) - Павел Михайлович Потапов, эксперт
2017 - Хождение по мукам - генерал Романовский
2017 - Елки новые - Виктор Орлов, отец Егора
2017 - Оперетта капитана Крутова - Борис Сергеевич Заболоцкий, кинорежиссер
2017 - Операция «Мухаббат» - Федор Николаевич Савельев, генерал-лейтенант
2017 - Частица вселенной - Геннадий Геннадьевич Яшин, российский космонавт
2017 - Со дна вершины - травматолог-ортопед
2018 - Золотая Орда - воевода Еремей
2018 - Идеалист - Глеб Федоров
2018 - Желтый глаз тигра - Михаил Гаврилович Звягинцев, полковник КГБ СССР
2019 - Шифр (сериал) - Константин Проскурин, майор Московского уголовного розыска, следователь
2019 - А у нас во дворе… 2 (сериал) - Владимир Сергеевич Каленый, отставной полицейский
2019 - Алекс Лютый (сериал) - Егор Сухарев
2019 - Холодные Берега (сериал) - Борис Новинский
2019 - Одесский пароход (фильм) - Миша
2019 - Русские горки (фильм) - Лев Штерингас
2020 - Временная связь (фильм) - Вадим Николаевич
2020 - На острие (фильм) - Гаврилов, тренер
2020 - Шифр 2 (сериал) - Константин Иванович Проскурин, начальник 1-го отдела МУРа, подполковник милиции
2021 - Идеалист (сериал) - Глеб Федоров
2021 - Шифр 3 (сериал) - Константин Иванович Проскурин, начальник 1-го отдела МУРа, подполковник милиции
2021 - Мария. Спасти Москву (фильм) - Комиссар НКВД
2021 - Бессмертные (фильм) - Архипов
2022 - Крылья на Берлином (фильм) - Семен Жаворонков
2022 - Сердце Пармы (фильм) - Полюд
2022 - Первый Оскар (фильм) - отец Юны
2022 - Напарник (сериал) - Иван Титов
2022 - Через прицел (сериал) - Васильев
2022 - Хронос (фильм) - Вадим Николаевич
2022 - Трейдер (сериал)
2023 - Доктор Х и его дети (фильм) - Доктор Христофоров
2015 - Клинч
2006 - Снегурочка - Лель, пастух
2007 - Собачья дверца
2011 - Сказка про елочку
2013 - Смелая мама (альманах «Зеленое яблоко») - читает текст
Первая жена - Эльвира Данилина. Брак продлился недолго, детей у них не было.
Вторая жена - Елена (брак с 1991), гидрогеолог.
Сын - Глеб (род. 1993).